Raziskovalno vprašanje

Postavili smo dve hipotezi:
⚬ Delež celične smrti oziroma preživetja celic in aktivnost kaspaz pri vseh tretiranih celičnih linijah narašča z daljšanjem časa inkubacije.
⚬ Resveratrol ima različen učinek na rakave in nerakave celice.

Slika 1: Karcinogeneza in angiogeneza

Raziskava

Resveratrol je antioksidant, ki je del naše prehrane. Znanstveniki že od leta 1990 raziskujejo njegov vpliv na zdravje, saj naj bi imel kar nekaj zdravstvenih učinkov. Sprva je bil povezan s 'Francoskim paradoksom', a so mu kasneje pripisali potencial za zdravljenje rakavih obolenj, srčno žilnih bolezni in nekaterih obolenj živčevja.
V zadnjem desetletju je zanimanje za resveratrol naraslo in nastaja vedno več raziskav o njegovih pozitivnih učinkih. Sklepajo, da imajo antioksidativne lastnosti, znižujejo LDL oksidacijo, kopičenje trombocitov in poškodbe eritrocitnih membran. Večina raziskav preučuje njihovo protimikrobno, antimutageno in antikancerogeno delovanje. Zavirajo peroksidacijo maščob ter varujejo genetski material celice pred poškodbami. Vseeno pa se v nekaterih študijah omenjajo nasprotni učinki, npr.: v visokih koncentracijah naj bi lahko delovali mutageno, pro-oksidativno in naj bi zavirali delovanje nekaterih ključnih encimov v metabolizmu hormonov.
Resveratrol naj bi pri razvoju raka vplival na inhibicijo angiogeneze, preprečuje aktivacijo karcinogeneze in povečuje sposobnost telesa, da hitreje odstrani škodljive molekule, zaviral naj bi celični cikel in spodbujal apoptozo. Kljub vsemu pa še številni pozitivni učinki niso bili potrjeni v kliničnih študijah. Do sedaj so v kliničnih študijah potrdili pozitivne učinke resveratrola samo pri kardiovaskularnih obolenjih, zato bo treba opraviti še veliko raziskav, da se bo pojasnil natančen mehanizem delovanja te molekule.
Resveratrol se trenutno uporablja kot prehransko dopolnilo, ki naj bi preprečilo razvoj nekaterih bolezni.
Še ena dobra stran te naravne spojine je, da so stranski učinki lahko zelo majhni oziroma jih ni, in da bi se resveratrol lahko z destilacijo pridobivalo iz korenin zelo invazivne rastline: japonskega dresnika (Fallopia japonica).

Slika 2: Trans- in Cis-resveratrol Slika 3: Japonski dresnik (<i>Fallopia japonica</i>)

Metoda

Za raziskavo smo izbrali tri različne celične linije: HeLa, HaCaT in U87. Te smo odmrznili in nacepili, dokler nismo imeli zadostno število celic za poskus. Nacepljene celice smo razdelili v 4 skupine, prva skupina je bila kontrolna in ni bila tretirana z resveratrolom, ostale tri pa so bile razdeljene glede na čas izpostavljenosti 100µM resveratrolu (24h, 48h in 72h).
Tretirane celice smo razdelili v 3 skupine; prva je bila uporabljena za mikroskopiranje, druga za pretočno citometrijo, tretja pa za merjenje kaspazne aktivnosti. Celice smo opazovali na 4x, 10x in 20x povečavi, da bi opazili morfološke spremembe, ki so nastale med različnimi tretiranjem z resveratrolom. Pri pretočni citometriji smo celice obarvali z reagentoma Annexin-V-PE in propidijevim jodidom in s pomočjo luminiscence določili delež mrtvih celic. Kaspazna aktivnost je bila določena glede na razlike v fluorescenci, ki je nastala zaradi rezanja te kaspaze z Ac-DEVD-AFC.